Condotto di guida del nervo: cos’è, mezzo artificiale

Un condotto di guida nervosa (noto anche come condotto nervoso artificiale o innesto nervoso artificiale , al contrario di un autotrapianto ) è un mezzo artificiale per guidare la ricrescita assonale per facilitare la rigenerazione nervosa ed è uno dei numerosi trattamenti clinici per le lesioni nervose . Quando la sutura diretta dei due monconi di un nervo reciso non può essere eseguita senza tensione, il trattamento clinico standard per le lesioni del nervo periferico èl’innesto di nervo autologo . A causa della disponibilità limitata di tessuto donatore e del recupero funzionale nell’innesto di nervi autologhi, nell’ingegneria dei tessuti neurali la ricerca si è concentrata sullo sviluppo di condotti di guida nervosa bioartificiale come trattamento alternativo, in particolare per difetti di grandi dimensioni. Tecniche simili sono allo studio anche per la riparazione dei nervi nel midollo spinale, ma la rigenerazione dei nervi nel sistema nervoso centrale rappresenta una sfida maggiore perché i suoi assoni non si rigenerano in modo apprezzabile nel loro ambiente nativo.

La creazione di condotti artificiali è anche nota come intubazione perché le estremità nervose e la fessura intermedia sono racchiuse all’interno di un tubo composto da materiali biologici o sintetici. Indipendentemente dal fatto che il condotto sia sotto forma di tubo biologico, tubo sintetico o condotto di ingegneria tissutale, dovrebbe facilitare la comunicazione neurotropica e neurotrofica tra le estremità prossimale e distale del gap nervoso, bloccare i fattori inibitori esterni e fornire una guida fisica per la ricrescita assonale. L’obiettivo fondamentale di un condotto di guida nervosa è quello di combinare segnali fisici, chimici e biologici in condizioni che favoriscono la formazione dei tessuti.

I materiali che sono stati utilizzati per realizzare tubi biologici includono vasi sanguigni e muscoli scheletrici, mentre i tubi sintetici non assorbibili e bioriassorbibili sono stati realizzati rispettivamente in silicone e poliglicolide I condotti di guida nervosa di ingegneria tissutale sono una combinazione di molti elementi: struttura dell’impalcatura, materiale dell’impalcatura, terapie cellulari, fattori neurotrofici e materiali biomimetici . La scelta di quali segnali fisici, chimici e biologici utilizzare si basa sulle proprietà dell’ambiente nervoso, che è fondamentale per creare l’ambiente più desiderabile per la rigenerazione degli assoni.I fattori che controllano la selezione dei materiali includono la biocompatibilità , biodegradabilità integrità meccanica, controllabilità durante la crescita dei nervi, l’impianto e la sterilizzazione.

Topografia dell’impalcatura

Nell’ingegneria dei tessuti , i tre livelli principali della struttura dell’impalcatura sono considerati:

  • la sovrastruttura, la forma complessiva dell’impalcatura;
  • la microstruttura, la struttura a livello cellulare della superficie; e
  • la nanostruttura, la struttura a livello subcellulare della superficie.

Sovrastruttura

La sovrastruttura di un condotto o di un’impalcatura è importante per simulare le condizioni in vivo per la formazione del tessuto nervoso. La matrice extracellulare, che è principalmente responsabile della direzione della crescita e della formazione dei tessuti, ha una sovrastruttura complessa creata da molte molecole fibrose intrecciate. I modi per formare la sovrastruttura artificiale includono l’uso di idrogel termo-reattivi, canali orientati longitudinalmente, fibre orientate longitudinalmente, assoni allungati e impalcature nanofibrose.

Idrogel termoreattivi

Nella lesione cerebrale traumatica (TBI), viene avviata una serie di eventi dannosi che portano alla morte cellulare e alla disfunzione generale, che causano la formazione di una cavità della lesione di forma irregolare. La cavità risultante causa molti problemi agli scaffold di ingegneria tessutale perché è richiesto l’impianto invasivo e spesso lo scaffold non è conforme alla forma della cavità. Per aggirare queste difficoltà, gli idrogel termo-reattivi sono stati progettati per subire transizioni soluzione-gelazione (sol-gel), che sono causate da differenze di temperatura ambiente e fisiologica, per facilitare l’impianto attraverso la gelificazione in situ e la conformazione alla forma della cavità causato, consentendo loro di essere iniettati in modo minimamente invasivo.

Metilcellulosa(MC) è un materiale con transizioni sol-gel ben definite nell’intervallo ottimale di temperature. La gelificazione MC si verifica a causa di un aumento delle interazioni idrofobiche intra e intermolecolari all’aumentare della temperatura. La transizione sol-gel è regolata dalla temperatura critica inferiore della soluzione (LCST), che è la temperatura alla quale il modulo elastico è uguale al modulo viscoso. Il LCST non deve superare la temperatura fisiologica (37 ° C) se lo scaffold deve gelificare al momento dell’impianto, creando una consegna minimamente invasiva. Dopo l’impianto in una cavità della lesione TBI o in un condotto di guida del nervo periferico, MC provoca una risposta infiammatoria minima. È anche molto importante per la consegna minimamente invasiva che la soluzione MC abbia una viscosità a temperature inferiori al suo LCST,applicazioni in vivo . MC è stato utilizzato con successo come agente di consegna per terapie farmaceutiche intra-ottiche e orali. Alcuni svantaggi di MC includono la sua propensione limitata per l’adsorbimento proteico e l’adesione cellulare neuronale che lo rende un idrogel non bioattivo. A causa di questi svantaggi, l’uso di MC nella rigenerazione del tessuto neurale richiede il collegamento di un gruppo biologicamente attivo sulla spina dorsale del polimero per migliorare l’adesione cellulare.

Un altro gel termosensibile è quello che si forma combinando il chitosano con il sale glicerofosfato (GP). Questa soluzione subisce la gelificazione a temperature superiori a 37 °C. La gelificazione del chitosano/GP è piuttosto lenta, impiegando mezz’ora per fissarsi inizialmente e altre 9 ore per stabilizzarsi completamente. La forza del gel varia da 67 a 1572 Pa a seconda della concentrazione di chitosano; l’estremità inferiore di questo intervallo si avvicina alla rigidità del tessuto cerebrale. Chitosano/GP ha mostrato successo in vitro , ma l’aggiunta di polilisina è necessaria per migliorare l’attaccamento delle cellule nervose. La polilisina è stata legata in modo covalente al chitosano per impedirne la diffusione. La polilisina è stata selezionata per la sua natura positiva e l’elevata idrofilia, che promuove i neuriticrescita. La sopravvivenza dei neuroni è stata raddoppiata, sebbene la crescita dei neuriti non sia cambiata con l’aggiunta di polilisina.

Canali orientati longitudinalmente

I canali orientati longitudinalmente sono strutture macroscopiche che possono essere aggiunte a un condotto per fornire agli assoni in rigenerazione una guida ben definita per la crescita lungo l’impalcatura. In un’impalcatura con microtubularearchitettura del canale, gli assoni rigeneranti sono in grado di estendersi attraverso canali longitudinali aperti come si estenderebbero normalmente attraverso i tubi endoneurali dei nervi periferici. Inoltre, i canali aumentano la superficie disponibile per il contatto cellulare. I canali vengono solitamente creati inserendo un ago, un filo o una seconda soluzione polimerica all’interno di un’impalcatura polimerica; dopo aver stabilizzato la forma del polimero principale, l’ago, il filo o il secondo polimero viene rimosso per formare i canali. In genere vengono creati più canali; tuttavia, l’impalcatura può essere costituita da un solo grande canale, che è semplicemente un tubo cavo.

Una tecnica di stampaggio è stata creata da Wang et al. per formare un condotto di guida nervosa con una matrice interna multicanale e una parete esterna del tubo in chitosano. Nel loro studio del 2006, Wang et al. aghi per agopuntura infilati attraverso un tubo cavo di chitosano, dove vengono tenuti in posizione fissando, su entrambe le estremità, patch create utilizzando CAD. Una soluzione di chitosano viene quindi iniettata nel tubo e solidificata, dopodiché gli aghi vengono rimossi, creando canali orientati longitudinalmente. È stato quindi creato uno scaffold rappresentativo per la caratterizzazione con 21 canali utilizzando aghi per agopuntura di 400 µm di diametro. All’esame al microscopio, i canali sono risultati essere approssimativamente circolari con lievi irregolarità; tutti i canali erano allineati con il diametro interno della parete esterna del tubo. È stato confermato dall’imaging micro-TC che i canali hanno attraversato l’intera lunghezza dell’impalcatura. Sotto l’assorbimento d’acqua, i diametri interno ed esterno dell’impalcatura sono diventati più grandi, ma i diametri del canale non sono variati in modo significativo, il che è necessario per mantenere la forma dell’impalcatura che guida l’estensione del neurite. La struttura interna fornisce un aumento della resistenza alla compressione rispetto a un tubo cavo da solo, che può impedire il collasso dell’impalcatura sui neuriti in crescita. Le cellule Neuro-2a sono state in grado di crescere sulla matrice interna dello scaffold e si sono orientate lungo i canali. Sebbene questo metodo sia stato testato solo su chitosano, può essere adattato ad altri materiali. ma i diametri dei canali non variavano in modo significativo, il che è necessario per mantenere la forma dell’impalcatura che guida l’estensione dei neuriti. La struttura interna fornisce un aumento della resistenza alla compressione rispetto a un tubo cavo da solo, che può impedire il collasso dell’impalcatura sui neuriti in crescita. Le cellule Neuro-2a sono state in grado di crescere sulla matrice interna dello scaffold e si sono orientate lungo i canali. Sebbene questo metodo sia stato testato solo su chitosano, può essere adattato ad altri materiali. ma i diametri dei canali non variavano in modo significativo, il che è necessario per mantenere la forma dell’impalcatura che guida l’estensione dei neuriti. La struttura interna fornisce un aumento della resistenza alla compressione rispetto a un tubo cavo da solo, che può impedire il collasso dell’impalcatura sui neuriti in crescita. Le cellule Neuro-2a sono state in grado di crescere sulla matrice interna dello scaffold e si sono orientate lungo i canali. Sebbene questo metodo sia stato testato solo su chitosano, può essere adattato ad altri materiali. e si orientarono lungo i canali. Sebbene questo metodo sia stato testato solo su chitosano, può essere adattato ad altri materiali. e si orientarono lungo i canali. Sebbene questo metodo sia stato testato solo su chitosano, può essere adattato ad altri materiali.

Il processo di liofilizzazione e riscaldamento del filo è un altro metodo per creare canali orientati longitudinalmente, sviluppato da Huang et al. (2005). Una soluzione di chitosano e acido acetico è stata congelata attorno a fili di nichel-rame (Ni-Cu) in azoto liquidotrappola; successivamente i fili venivano riscaldati e rimossi. I fili Ni-Cu sono stati scelti perché hanno un alto livello di resistenza. Per sublimare l’acido acetico sono stati utilizzati liofilizzatori a temperatura controllata. Non c’erano prove della fusione o della divisione dei canali. Dopo la liofilizzazione, le dimensioni dell’impalcatura si sono ridotte facendo sì che i canali fossero un po’ più piccoli del filo utilizzato. Gli scaffold sono stati neutralizzati a un valore di pH fisiologico utilizzando una base, che ha avuto effetti drammatici sulla struttura porosa. Basi più deboli mantenevano uniforme la struttura porosa, ma basi più forti la rendevano incontrollabile. La tecnica utilizzata qui può essere leggermente modificata per adattarsi ad altri polimeri e solventi.

Un altro modo per creare canali orientati longitudinalmente è creare un condotto da un polimero con fibre orientate longitudinalmente incorporate da un altro polimero; quindi dissolvere selettivamente le fibre per formare canali orientati longitudinalmente. Le fibre di policaprolattone (PCL) sono state incorporate in un’impalcatura di (idrossietil) metacrilato (HEMA). PCL è stato scelto su poli (acido lattico) (PLA) e poli (acido lattico-co-glicolico) (PLGA), perché è insolubile in HEMA ma solubile in acetone. Questo è importante perché HEMA è stato utilizzato per il materiale del condotto principale e l’acetone è stato utilizzato per dissolvere selettivamente le fibre polimeriche. Le fibre PCL estruse sono state inserite in un tubo di vetro e la soluzione HEMA è stata iniettata. Il numero di canali creati era costante da lotto a lotto e le variazioni nel diametro delle fibre potevano essere ridotte creando un sistema di estrusione delle fibre PCL più controllato. I canali formati sono stati confermati essere continui e omogenei dall’esame delle variazioni di porosità. Questo processo è sicuro, riproducibile e ha dimensioni controllabili. In uno studio simile condotto da Yu e Shoichet (2005), HEMA è stato copolimerizzato con AEMA per creare un gel P(HEMA-co-AMEA). Le fibre di policaprolattone (PCL) sono state incorporate nel gel e quindi dissolte selettivamente dall’acetone con sonicazione per creare canali. Si è riscontrato che HEMA in miscela con l’1% di AEMA ha creato i gel più forti. Rispetto agli scaffold senza canali, l’aggiunta di 82-132 canali può fornire un aumento della superficie di circa 6-9 volte, il che può essere vantaggioso per gli studi di rigenerazione che dipendono da segnali mediati dal contatto.

Ito et al. (2003) hanno sviluppato un’impalcatura costituita da un unico grande canale orientato longitudinalmente è stato creato utilizzando i tendini chitosano dei granchi. I tendini sono stati raccolti dai granchi (Macrocheira kaempferi) e lavati ripetutamente con una soluzione di idrossido di sodio per rimuovere le proteine ​​e deacetilare la chitina del tendine, che in seguito divenne noto come tendine chitosano. Una barra di acciaio inossidabile con sezione trasversale di forma triangolare (ogni lato lungo 2,1 mm) è stata inserita in un tubo di chitosano tendine cavo di sezione trasversale di forma circolare (diametro: 2 mm; lunghezza: 15 mm). Confrontando i tubi di forma circolare e triangolare, si è scoperto che i tubi triangolari avevano una migliore resistenza meccanica, mantenevano meglio la loro forma e aumentavano la superficie disponibile. Sebbene questo sia un metodo efficace per creare un singolo canale, non fornisce la stessa superficie per la crescita cellulare delle impalcature multicanale.

Newmann et al. (2006) hanno inserito fibre conduttive e non conduttive in uno scaffold di collagene-TERP (collagene reticolato con un terpolimero di poli(N-isopropilacrilammide) (PNiPAAm)). Le fibre sono state incorporate avvolgendole strettamente su un piccolo vetrino e inserendo una soluzione di collagene-TERP tra esso e un altro vetrino; i distanziatori tra i vetrini impostano lo spessore del gel a 800 µm. Le fibre conduttive erano in fibra di carbonio e Kevlar, e le fibre non conduttive erano nylon-6 e filo di tungsteno. I neuriti si estendono in tutte le direzioni in spessi fasci sulla fibra di carbonio; tuttavia con le altre tre fibre, i neuriti si estendevano in sottili conformazioni simili a ragnatele. I neuriti non hanno mostrato una crescita direzionale sulle fibre di carbonio e Kevlar, ma sono cresciuti lungo le fibre di nylon-6 e in una certa misura lungo il filo di tungsteno. Il filo di tungsteno e le impalcature in fibra di nylon-6 hanno fatto crescere i neuriti nel gel vicino all’interfaccia fibra-gel oltre a crescere lungo la superficie. Tutti i gel in fibra tranne il Kevlar hanno mostrato un aumento significativo dell’estensione dei neuriti rispetto ai gel non in fibra. Non c’era differenza nell’estensione dei neuriti tra le fibre non conduttive e quelle conduttive.

Nel loro studio del 2005, Cai et al. microfilamenti di poli (acido L-lattico) (PLLA) aggiunti a tubi cavi di poli (acido lattico) (PLA) e silicio. Le caratteristiche di guida della microfibra erano inversamente correlate al diametro della fibra con diametri più piccoli che promuovevano una migliore migrazione cellulare orientata longitudinalmente e la rigenerazione assonale. Le microfibre hanno anche promosso la mielinizzazione durante la riparazione dei nervi periferici.

Assoni allungati

È stato dimostrato che i tratti di assoni maturi subiscono una crescita quando vengono stirati meccanicamente nella parte centrale del cilindro degli assoni. Tale allungamento meccanico è stato applicato da un bioreattore di crescita dell’assone personalizzato composto da quattro componenti principali: camera di espansione dell’assone progettata su misura, tavolo di movimento lineare, motore passo-passo e controller. La coltura del tessuto nervoso è collocata all’interno della camera di espansione con una porta per lo scambio di gas e un telaio di allungamento rimovibile, che è in grado di separare due gruppi di somi (corpi cellulari neuronali) e quindi allungare i loro assoni. Il gel di collagene è stato utilizzato per promuovere la crescita di tratti di assoni più grandi che erano visibili ad occhio nudo. Ci sono due ragioni per l’aumento della crescita dovuto al rivestimento di collagene: 1) la coltura è diventata idrofobica dopo che il collagene si è asciugato, che ha consentito la crescita di una concentrazione più densa di neuroni e 2) il rivestimento di collagene ha creato un rivestimento non ostruito attraverso i due substrati di allungamento. Esame diil microscopio elettronico a scansione e il TEM non hanno mostrato segni di assottigliamento degli assoni dovuto all’allungamento e il citoscheletro sembrava essere normale e intatto. I tratti di assoni allungati sono stati coltivati ​​su una membrana biocompatibile, che potrebbe essere formata direttamente in una struttura cilindrica per il trapianto, eliminando la necessità di trasferire gli assoni su un’impalcatura dopo che la crescita è stata completata. Gli assoni allungati sono stati in grado di crescere a un tasso senza precedenti di 1 cm/giorno dopo soli 8 giorni di acclimatazione, che è molto maggiore del tasso di crescita massimo di 1 mm/giorno misurato per l’estensione del cono di crescita. La velocità di 1 mm/giorno è anche la velocità media di trasporto per elementi strutturali come i neurofilamenti.

Scaffold in nanofibre

La ricerca sulle fibre su scala nanometrica tenta di imitare l’ ambiente extracellulare in vivo al fine di promuovere la crescita direzionale e la rigenerazione. Tre metodi distinti per formare impalcature nanofibrose sono l’autoassemblaggio, la separazione di fase e l’elettrofilatura. Tuttavia, ci sono molti altri metodi per formare impalcature nanofibrose.

L’autoassemblaggio di scaffold nanofibrosi può avvenire solo quando le fibre stesse sono progettate per l’autoassemblaggio. Un modo comune per guidare l’autoassemblaggio delle fibre dell’impalcatura è utilizzare peptidi anfifilici in modo che in acqua la frazione idrofobica guidi l’autoassemblaggio. L’ingegnerizzazione attentamente calcolata dei peptidi anfifilici consente un controllo preciso sulla matrice autoassemblata. L’autoassemblaggio è in grado di creare topografie sia ordinate che non ordinate. Phillips et al. (2005) hanno sviluppato e testato in vitro e in vivo un collagene autoallineato – matrice di cellule di Schwann , che ha permesso l’allineamento dell’estensione dei neuriti DRG in vitro . I gel di collagene sono stati ampiamente utilizzati come substrati per la tridimensionalitàcoltura tissutale . Le cellule sono in grado di formare legami mediati dall’integrina con il collagene, che avvia l’assemblaggio del citoscheletro e la motilità cellulare. Quando le cellule si muovono lungo le fibre di collagene, generano forze che contraggono il gel. Quando le fibre di collagene sono legate a entrambe le estremità, le forze generate dalle cellule creano una tensione uniassiale, provocando l’allineamento delle cellule e delle fibre di collagene. I vantaggi di questa matrice sono la semplicità e la velocità di preparazione. Fibronectina plasmatica solubilepuò anche autoassemblarsi in fibre insolubili stabili quando sottoposto a taglio meccanico diretto all’interno di una soluzione viscosa. Phillips et al. (2004) hanno studiato un nuovo metodo di aggregazione di taglio che provoca una migliore aggregazione. Il taglio meccanico è stato creato trascinando un bolo da 0,2 ml a 3 cm con una pinza; la fibronectina si aggrega in fibre insolubili all’interfaccia in rapido movimento in una cella di ultrafiltrazione. Il meccanismo proposto per questa aggregazione delle fibre è l’estensione e l’allungamento delle proteine ​​sotto la forza di taglio meccanica, che porta all’impaccamento laterale e all’aggregazione proteica delle fibre. Phillips et al. ha mostrato che il taglio meccanico prodotto dallo stiramento di un gel di fibronectina ad alta viscosità provoca cambiamenti sostanziali nella sua struttura e che, quando applicato attraverso l’estensione uniassiale, un gel di fibronectina viscosa forma aggregati di fibronectina fibrosa orientata; inoltre, gli aggregati fibrosi hanno una ridotta solubilità e possono supportare i vari tipi cellulari in vitro.

La separazione di fase consente di creare scaffold tridimensionali in fibra sub-micrometrica senza l’uso di attrezzature specializzate. I cinque passaggi coinvolti nella separazione di fase sono la dissoluzione del polimero, la separazione di fase e la gelificazione, l’estrazione con solvente dal gel, il congelamento e la liofilizzazione in acqua. Il prodotto finale è una rete in fibra continua. La separazione di fase può essere modificata per adattarsi a molte applicazioni diverse e la struttura dei pori può essere variata utilizzando diversi solventi, che possono modificare l’intero processo da liquido-liquido a solido-liquido. Anche la porosità e il diametro delle fibre possono essere modificati variando la concentrazione iniziale del polimero; una maggiore concentrazione iniziale porta a meno pori e diametri delle fibre maggiori. Questa tecnica può essere utilizzata per creare reti di fibre con diametri che raggiungono i diametri delle fibre di collagene di tipo I. La rete fibrosa creata è orientata in modo casuale e finora non è stato fatto alcun lavoro per tentare di organizzare le fibre. La separazione di fase è una tecnica ampiamente utilizzata per creare con facilità scaffold nanofibrosi altamente porosi.

Electrospinningfornisce una solida piattaforma per lo sviluppo di condotti sintetici per la guida dei nervi. L’elettrofilatura può servire per creare impalcature a dimensioni controllate con chimica e topografia variabili. Inoltre, diversi materiali possono essere incapsulati all’interno di fibre tra cui particelle, fattori di crescita e persino cellule. L’elettrofilatura crea fibre caricando elettricamente una goccia di polimero fuso o soluzione e sospendendola da un capillare. Quindi, viene applicato un campo elettrico a un’estremità del capillare finché la carica non supera la tensione superficiale, creando un getto di polimero che si allunga e si assottiglia. Questo getto di polimero si scarica come un cono di Taylor, lasciando dietro di sé polimeri caricati elettricamente, che vengono raccolti su una superficie messa a terra come solvente mentre il solvente evapora dai getti. Le fibre sono state filate con diametri che vanno da meno di 3 nm a oltre 1 µm. Il processo è influenzato da parametri di sistema come il tipo di polimero, il peso molecolare del polimero e le proprietà della soluzione e da parametri di processo come portata, voltaggio, diametro del capillare, distanza tra il collettore e il capillare e movimento del collettore. Il reticolo fibroso creato è disordinato e contiene un elevato rapporto superficie/volume a causa di un’elevata porosità; un’ampia superficie di rete è ideale per la crescita e il trasporto di rifiuti e sostanze nutritive nell’ingegneria dei tessuti neurali. Le due caratteristiche degli scaffold elettrofilati che sono vantaggiose per l’ingegneria dei tessuti neurali sono la morfologia e l’architettura, che imita da vicino l’ECM, e i pori, che sono la corretta gamma di dimensioni che consente lo scambio di nutrienti ma impedisce la crescita del tessuto cicatriziale gliale (circa 10 µm). È stato dimostrato che gli scaffold PLLA elettrofilati casuali hanno una maggiore adesione cellulare, che può essere dovuta a una maggiore rugosità superficiale. È stato anche dimostrato che i tappetini in fibra elettrofilata modificati chimicamente influenzano la differenziazione delle cellule staminali neurali e aumentano la proliferazione cellulare. Nell’ultimo decennio, gli scienziati hanno anche sviluppato numerosi metodi per la produzione di scaffold allineati in nanofibre, che servono a fornire ulteriori segnali topografici alle cellule. Ciò è vantaggioso perché non è possibile creare facilmente scaffold allineati tridimensionali su larga scala utilizzando le tecniche di fabbricazione tradizionali. In uno studio condotto da Yang et al. (2005), Sono stati creati, caratterizzati e confrontati scaffold microfibrosi e nanofibrosi allineati e casuali poli (acido L-lattico) (PLLA). I diametri delle fibre erano direttamente proporzionali alla concentrazione iniziale del polimero utilizzato per l’elettrofilatura; il diametro medio delle fibre allineate era inferiore a quello delle fibre casuali in condizioni di lavorazione identiche. È stato dimostrato che le cellule staminali neurali si allungavano parallelamente alle fibre elettrofilate allineate. Le nanofibre allineate avevano una lunghezza media dei neuriti più lunga rispetto alle microfibre allineate, alle microfibre casuali e alle nanofibre casuali. Inoltre, più cellule differenziate su nanofibre allineate rispetto a microfibre allineate. Pertanto, i risultati di questo studio hanno dimostrato che le nanofibre allineate possono essere più vantaggiose delle fibre o delle microfibre non allineate per promuovere la rigenerazione dei nervi. I diametri delle fibre erano direttamente proporzionali alla concentrazione iniziale del polimero utilizzato per l’elettrofilatura; il diametro medio delle fibre allineate era inferiore a quello delle fibre casuali in condizioni di lavorazione identiche. È stato dimostrato che le cellule staminali neurali si allungavano parallelamente alle fibre elettrofilate allineate. Le nanofibre allineate avevano una lunghezza media dei neuriti più lunga rispetto alle microfibre allineate, alle microfibre casuali e alle nanofibre casuali. Inoltre, più cellule differenziate su nanofibre allineate rispetto a microfibre allineate. Pertanto, i risultati di questo studio hanno dimostrato che le nanofibre allineate possono essere più vantaggiose delle fibre o delle microfibre non allineate per promuovere la rigenerazione dei nervi. I diametri delle fibre erano direttamente proporzionali alla concentrazione iniziale del polimero utilizzato per l’elettrofilatura; il diametro medio delle fibre allineate era inferiore a quello delle fibre casuali in condizioni di lavorazione identiche. È stato dimostrato che le cellule staminali neurali si allungavano parallelamente alle fibre elettrofilate allineate. Le nanofibre allineate avevano una lunghezza media dei neuriti più lunga rispetto alle microfibre allineate, alle microfibre casuali e alle nanofibre casuali. Inoltre, più cellule differenziate su nanofibre allineate rispetto a microfibre allineate. Pertanto, i risultati di questo studio hanno dimostrato che le nanofibre allineate possono essere più vantaggiose delle fibre o delle microfibre non allineate per promuovere la rigenerazione dei nervi. il diametro medio delle fibre allineate era inferiore a quello delle fibre casuali in condizioni di lavorazione identiche. È stato dimostrato che le cellule staminali neurali si allungavano parallelamente alle fibre elettrofilate allineate. Le nanofibre allineate avevano una lunghezza media dei neuriti più lunga rispetto alle microfibre allineate, alle microfibre casuali e alle nanofibre casuali. Inoltre, più cellule differenziate su nanofibre allineate rispetto a microfibre allineate. Pertanto, i risultati di questo studio hanno dimostrato che le nanofibre allineate possono essere più vantaggiose delle fibre o delle microfibre non allineate per promuovere la rigenerazione dei nervi. il diametro medio delle fibre allineate era inferiore a quello delle fibre casuali in condizioni di lavorazione identiche. È stato dimostrato che le cellule staminali neurali si allungavano parallelamente alle fibre elettrofilate allineate. Le nanofibre allineate avevano una lunghezza media dei neuriti più lunga rispetto alle microfibre allineate, alle microfibre casuali e alle nanofibre casuali. Inoltre, più cellule differenziate su nanofibre allineate rispetto a microfibre allineate. Pertanto, i risultati di questo studio hanno dimostrato che le nanofibre allineate possono essere più vantaggiose delle fibre o delle microfibre non allineate per promuovere la rigenerazione dei nervi. più cellule differenziate su nanofibre allineate rispetto a microfibre allineate. Pertanto, i risultati di questo studio hanno dimostrato che le nanofibre allineate possono essere più vantaggiose delle fibre o delle microfibre non allineate per promuovere la rigenerazione dei nervi. più cellule differenziate su nanofibre allineate rispetto a microfibre allineate. Pertanto, i risultati di questo studio hanno dimostrato che le nanofibre allineate possono essere più vantaggiose delle fibre o delle microfibre non allineate per promuovere la rigenerazione dei nervi.

Microstructure and nanostructure

La microstruttura e la nanostruttura, insieme alla sovrastruttura, sono tre livelli principali della struttura dell’impalcatura che meritano considerazione quando si crea la topografia dell’impalcatura. Mentre la sovrastruttura si riferisce alla forma complessiva dell’impalcatura, la microstruttura si riferisce alla struttura a livello cellulare della superficie e la nanostruttura si riferisce alla struttura a livello subcellulare della superficie. Tutti e tre i livelli di struttura sono in grado di suscitare risposte cellulari; tuttavia, vi è un notevole interesse nella risposta delle cellule alla topografia su scala nanometrica motivata dalla presenza di numerose strutture su scala nanometrica all’interno della matrice extracellulare. Esiste un numero crescente di metodi per la fabbricazione di micro e nanostrutture (molti provenienti dall’industria dei semiconduttori) che consentono la creazione di varie topografie con dimensioni, forma,

Segnali fisici

I segnali fisici si formano creando una struttura superficiale ordinata a livello di microstruttura e/o nanostruttura. È stato dimostrato che segnali fisici su scala nanometrica modulano l’adesione cellulare, la migrazione, l’orientamento, l’inibizione del contatto, l’espressione genica e la formazione del citoscheletro. Ciò consente la direzione dei processi cellulari come la proliferazione, la differenziazione e la diffusione. Esistono numerosi metodi per la produzione di topografie su micro e nanoscala, che possono essere suddivisi in quelli che creano topografie ordinate e quelli che creano topografie non ordinate.

Le topografie ordinate sono definite come schemi organizzati e geometricamente precisi. Sebbene esistano molti metodi per creare topografie ordinate, di solito richiedono molto tempo, abilità ed esperienza e l’uso di attrezzature costose.

La fotolitografia comporta l’esposizione di una sorgente luminosa a un wafer di silicio rivestito di fotoresist; una maschera con il motivo desiderato viene posta tra la sorgente luminosa e il wafer, consentendo così selettivamente alla luce di filtrare e creare il motivo sul fotoresist . L’ulteriore sviluppo del wafer mette in risalto il modello nel fotoresist. La fotolitografia eseguita nel vicino UV è spesso vista come lo standard per fabbricare topografie su microscala. Tuttavia, poiché il limite inferiore per le dimensioni è una funzione della lunghezza d’onda, questo metodo non può essere utilizzato per creare caratteristiche su scala nanometrica. Nel loro studio del 2005, Mahoney et al. creato array organizzati di poliimmidei canali (11 µm di altezza e 20-60 µm di larghezza) sono stati creati su un substrato di vetro mediante fotolitografia. La poliimmide è stata utilizzata perché aderisce bene al vetro, è chimicamente stabile in soluzione acquosa ed è biocompatibile. Si ipotizza che i microcanali limitassero la gamma di angoli che gli elementi del citoscheletro all’interno dei coni di crescita dei neuriti potevano accumulare, assemblare e orientare. C’è stata una significativa diminuzione del numero di neuriti emergenti dal soma; tuttavia, la diminuzione è stata minore all’aumentare dell’intervallo di angoli su cui sono emersi i neuriti. Inoltre, i neuriti erano in media due volte più lunghi quando i neuroni venivano coltivati ​​sui microcanali rispetto ai controlli su una superficie piana; ciò potrebbe essere dovuto ad un più efficiente allineamento dei filamenti.

Nella litografia a fascio di elettroni(EBL), un resist sensibile agli elettroni è esposto a un fascio di elettroni ad alta energia. C’è la scelta di un resist di tipo positivo o negativo; tuttavia, è possibile ottenere una risoluzione delle caratteristiche inferiore con resist negativi. I modelli vengono creati programmando il raggio di elettroni per il percorso esatto da seguire lungo la superficie del materiale. La risoluzione è influenzata da altri fattori come lo scattering di elettroni nel resist e il backscattering dal substrato. EBL può creare singole caratteristiche superficiali dell’ordine di 3-5 nm. Se sono necessarie più caratteristiche su un’ampia superficie, come nel caso dell’ingegneria dei tessuti, la risoluzione diminuisce e le caratteristiche possono essere create solo fino a 30-40 nm e lo sviluppo del resist inizia a pesare maggiormente sulla formazione del modello. Per impedire lo scioglimento del resist, l’agitazione ultrasonica può essere utilizzata per superare le forze intermolecolari. Inoltre,l’alcool isopropilico (IPA) aiuta a sviluppare array ad alta densità. L’EBL può diventare un processo più rapido e meno costoso replicando modelli nanometrici in materiali polimerici; il processo di replicazione è stato dimostrato con il policaprolattone (PCL) mediante goffratura a caldo e fusione con solvente . In uno studio condotto da Gomez et al. (2007), è stato dimostrato che i microcanali larghi 1 e 2 µm e profondi 400 e 800 nm creati da EBL su PDMS migliorano la formazione di assoni delle cellule ippocampali in coltura più dei segnali chimici immobilizzati.

Litografia a raggi Xè un altro metodo per formare modelli ordinati che possono essere utilizzati per studiare il ruolo che la topografia svolge nella promozione della neuritogenesi. I parametri della maschera determinano la periodicità del modello, ma la larghezza e la profondità della cresta sono determinate dalle condizioni di incisione. In uno studio, sono state create creste con periodi compresi tra 400 e 4000 nm, larghezze comprese tra 70 e 1900 nm e una profondità del solco di 600 nm; lo sviluppo di neuriti ha dimostrato una guida al contatto con caratteristiche di appena 70 nm e più del 90% dei neuriti erano entro 10 gradi di allineamento parallelo con le creste e le scanalature. Non c’era una differenza significativa nell’orientamento rispetto alle dimensioni delle caratteristiche utilizzate. Il numero di neuriti per cellula era limitato dalle creste e dai solchi, producendo fenotipi bipolari piuttosto che ramificati.

Le topografie non ordinate sono generalmente create da processi che si verificano spontaneamente durante altre elaborazioni; i modelli sono casuali nell’orientamento e nell’organizzazione con controllo impreciso o assente sulla geometria delle caratteristiche. Il vantaggio di creare topografie non ordinate rispetto a quelle ordinate è che i processi sono spesso meno dispendiosi in termini di tempo, meno costosi e non richiedono grande abilità ed esperienza. Le topografie non ordinate possono essere create mediante demiscelazione di polimeri, litografia colloidale e incisione chimica.

Nella demiscelazione dei polimeri, le miscele di polimeri subiscono una separazione di fase spontanea; si verifica spesso durante condizioni come lo spin casting su wafer di silicio. Le caratteristiche che possono essere create con questo metodo includono pozzi, isole e nastri su nanoscala, che possono essere controllati in una certa misura regolando il rapporto e la concentrazione del polimero per modificare rispettivamente la forma e le dimensioni della caratteristica. Non c’è molto controllo nella direzione orizzontale, sebbene la direzione verticale delle caratteristiche possa essere controllata con precisione. Poiché il modello è molto disordinato orizzontalmente, questo metodo può essere utilizzato solo per studiare le interazioni cellulari con nanotopografie di altezza specifica .

La litografia colloidale è poco costosa e può essere utilizzata per creare superfici con altezze e diametri controllati. I nanocolliod vengono utilizzati come maschera di incisione diffondendoli lungo la superficie del materiale, quindi il bombardamento del raggio ionico o l’evaporazione del film viene utilizzato per incidere attorno ai nanocolliod, creando rispettivamente nanocolonne e nanopit. La struttura superficiale finale può essere controllata variando l’area coperta dai colloidi e la dimensione del colloide. L’area coperta dai colloidi può essere cambiata modificando la forza ionica della soluzione colloidale. Questa tecnica è in grado di creare ampie superfici modellate, necessarie per le applicazioni di ingegneria tissutale.

L’attacco chimico prevede l’immersione della superficie del materiale in un agente di attacco come l’acido fluoridrico (HF) o l’idrossido di sodio (NaOH) fino a quando la superficie non viene incisa fino a raggiungere la ruvidità desiderata creata da cavità e sporgenze su scala nanometrica. Tempi di incisione più lunghi portano a superfici più ruvide (vale a dire fossette superficiali e sporgenze più piccole). Strutture con geometria o organizzazione specifica non possono essere create con questo metodo rudimentale perché nella migliore delle ipotesi può essere considerato un trattamento superficiale per modificare la rugosità superficiale. I vantaggi significativi di questo metodo sono la facilità d’uso e il basso costo per la creazione di una superficie con nanotopografie . I wafer di silicio sono stati incisi utilizzando HF ed è stato dimostrato che l’adesione cellulare è stata migliorata solo in un intervallo specificato di rugosità (20-50 nm).

Segnali chimici

Oltre a creare la topografia con segnali fisici, può essere creata con segnali chimici depositando selettivamente la soluzione polimerica in modelli sulla superficie di un substrato. Esistono diversi metodi per depositare i segnali chimici. Due metodi per l’erogazione di soluzioni chimiche includono il motivo a strisce e la microerogazione piezoelettrica.

Film polimerici a striscepuò essere formato su substrati solidi colando una soluzione polimerica diluita. Questo metodo è relativamente facile, poco costoso e non ha restrizioni sui materiali dell’impalcatura che possono essere utilizzati. La procedura prevede la sovrapposizione orizzontale di lastre di vetro mantenendole separate verticalmente da uno stretto spazio riempito con una soluzione polimerica. La piastra superiore viene spostata a una velocità costante compresa tra 60 e 100 µm/s. Una sottile pellicola liquida di soluzione si forma continuamente sul bordo del vetro scorrevole in seguito all’evaporazione del solvente. I motivi a strisce preparati a velocità di 60, 70 e 100 µm/s hanno creato larghezze e spaziature delle scanalature rispettivamente di 2,2 e 6,1 µm, 3,6 e 8,4 µm e 4,3 e 12,7 µm; la gamma di altezze per le creste era di 50-100 nm. Tsuruma, Tanaka et al. dimostrato che le cellule neurali embrionali coltivate su pellicola rivestita con poli-L-lisina attaccate e allungate parallelamente alle strisce di poli (ε-caprolattone)/soluzione di cloroformio (1 g/L) con larghezza e spaziatura del motivo strette (larghezza: 2,2 µm, spaziatura: 6,1 µm). Tuttavia, i neuroni sono cresciuti lungo l’asse dei pattern con ampia larghezza e spaziatura (larghezza: 4,3 µm, spaziatura: 12,7 µm). In media, i neuroni sui film con motivo a strisce avevano meno neuriti per cellula e neuriti più lunghi rispetto ai neuroni sui film senza motivo. Pertanto, i parametri del pattern a strisce sono in grado di determinare la direzione di crescita, la lunghezza dei neuriti e il numero di neuriti per cellula. i neuroni sono cresciuti lungo l’asse dei modelli con ampia larghezza e spaziatura (larghezza: 4,3 µm, spaziatura: 12,7 µm). In media, i neuroni sui film con motivo a strisce avevano meno neuriti per cellula e neuriti più lunghi rispetto ai neuroni sui film senza motivo. Pertanto, i parametri del pattern a strisce sono in grado di determinare la direzione di crescita, la lunghezza dei neuriti e il numero di neuriti per cellula. i neuroni sono cresciuti lungo l’asse dei modelli con ampia larghezza e spaziatura (larghezza: 4,3 µm, spaziatura: 12,7 µm). In media, i neuroni sui film con motivo a strisce avevano meno neuriti per cellula e neuriti più lunghi rispetto ai neuroni sui film senza motivo. Pertanto, i parametri del pattern a strisce sono in grado di determinare la direzione di crescita, la lunghezza dei neuriti e il numero di neuriti per cellula.

La microerogazione è stata utilizzata per creare micromodelli su piatti di coltura in polistirene erogando goccioline di laminina adesiva e soluzioni di albumina di siero bovino (BSA) non adesive. Il microdispenser è un piezoelettricoelemento fissato a una barra di spinta in cima a un canale inciso nel silicio, che ha un ingresso a ciascuna estremità e un ugello al centro. L’elemento piezoelettrico si espande quando viene applicata la tensione, provocando l’erogazione del liquido attraverso l’ugello. Il microdispenser viene spostato utilizzando un tavolo xy controllato da computer. La risoluzione del micropattern dipende da molti fattori: viscosità del liquido erogato, passo delle gocce (la distanza tra il centro di due goccioline adiacenti in una linea o matrice) e il substrato. Con l’aumentare della viscosità le linee si assottigliano, ma se la viscosità del liquido è troppo alta il liquido non può essere espulso. Il riscaldamento della soluzione crea linee proteiche più uniformi. Sebbene sia necessaria una certa sovrapposizione di goccioline per creare linee continue, l’evaporazione non uniforme può causare una concentrazione proteica non uniforme lungo le linee;

Per i modelli contenenti 0,5 mg/ml di laminina, una percentuale maggiore di neuriti è cresciuta sulle linee microdosate rispetto a quelle tra le linee. Su modelli di proteine ​​BSA da 10 mg/ml e 1 mg/ml e modelli di proteine ​​BSA prive di acidi grassi, un numero significativo di neuriti ha evitato le linee proteiche ed è cresciuto tra le linee. Pertanto, le linee BSA contenenti acidi grassi erano altrettanto non permissive per la crescita dei neuriti quanto le linee contenenti BSA con acidi grassi. Poiché la microerogazione non richiede il contatto diretto con le superfici del substrato, questa tecnica può utilizzare superfici con micro o nanotopologia delicata che potrebbero essere distrutte dal contatto. È possibile variare la quantità di proteine ​​depositate erogando più o meno goccioline. Un vantaggio della microerogazione è che i modelli possono essere creati rapidamente in 5-10 minuti.

Scaffold material

La selezione del materiale dell’impalcatura è forse la decisione più importante da prendere. Deve essere biocompatibile e biodegradabile; inoltre, deve essere in grado di incorporare qualsiasi indizio fisico, chimico o biologico desiderato, il che nel caso di alcuni segnali chimici significa che deve avere un sito disponibile per il collegamento chimico di peptidi e altre molecole. I materiali dell’impalcatura scelti per i condotti di guida nervosa sono quasi sempre idrogel. L’idrogel può essere composto da polimeri biologici o sintetici. Sia i polimeri biologici che quelli sintetici hanno i loro punti di forza e di debolezza. È importante notare che il materiale del condotto può causare un recupero inadeguato quando (1) i tassi di degradazione e riassorbimento non corrispondono al tasso di formazione del tessuto, (2) le proprietà di stress-deformazione non si confrontano bene con quelle del tessuto neurale,

Idrogel

Idrogelsono una classe di biomateriali che sono polimeri solubili in acqua reticolati chimicamente o fisicamente. Possono essere degradabili o non degradabili come determinato dalla loro chimica, ma la degradabilità è più desiderabile quando possibile. C’è stato un grande interesse per gli idrogel per scopi di ingegneria dei tessuti, perché generalmente possiedono un’elevata biocompatibilità, proprietà meccaniche simili ai tessuti molli e la capacità di essere iniettati come un liquido che gelifica. Quando gli idrogel sono reticolati fisicamente, devono fare affidamento sulla separazione di fase per la gelificazione; la separazione di fase è dipendente dalla temperatura e reversibile. Alcuni altri vantaggi degli idrogel sono che utilizzano solo solventi acquosi non tossici, consentono l’infusione di sostanze nutritive e l’uscita di prodotti di scarto e consentono alle cellule di assemblarsi spontaneamente. Gli idrogel hanno una bassa tensione interfacciale, il che significa che le cellule possono migrare facilmente attraverso il confine tessuto-impianto. Tuttavia, con gli idrogel è difficile formare un’ampia gamma di proprietà meccaniche o strutture con dimensione dei pori controllata.

Polimero sintetico

Un polimero sintetico può essere non degradabile o degradabile. Ai fini dell’ingegneria dei tessuti neurali, i materiali degradabili sono preferiti quando possibile, poiché gli effetti a lungo termine come l’infiammazione e la cicatrice potrebbero danneggiare gravemente la funzione nervosa. La velocità di degradazione dipende dal peso molecolare del polimero, dalla sua cristallinità e dal rapporto tra subunità di acido glicolico e acido lattico. A causa di un gruppo metilico , l’acido lattico è più idrofobo dell’acido glicolicofacendo sì che la sua idrolisi sia più lenta. I polimeri sintetici hanno proprietà meccaniche più maneggevoli e tassi di degradazione che possono essere controllati su un’ampia gamma ed eliminano la preoccupazione per l’immunogenicità. Ci sono molti diversi polimeri sintetici attualmente utilizzati nell’ingegneria dei tessuti neurali. Tuttavia, gli svantaggi di molti di questi polimeri includono una mancanza di biocompatibilità e bioattività, che impedisce a questi polimeri di promuovere l’attaccamento, la proliferazione e la differenziazione delle cellule. I condotti sintetici hanno avuto successo clinico solo per la riparazione di lacune di lesioni nervose molto corte inferiori a 1-2 cm. Inoltre, la rigenerazione nervosa con questi condotti deve ancora raggiungere il livello di recupero funzionale osservato con autoinnesti nervosi.

Collagene-terpolimero

Il collagene è un componente importante della matrice extracellulare e si trova nei tessuti di supporto dei nervi periferici. Un terpolimero (TERP) è stato sintetizzato mediante copolimerizzazione radicalica dei suoi tre monomeri e reticolato con il collagene, creando un’impalcatura ibrida di idrogel biologico-sintetico. Il terpolimero è a base di poli(NIPAAM), noto per essere un polimero amico delle cellule. TERP è utilizzato sia come reticolante per aumentare la robustezza dell’idrogel sia come sito per l’innesto di peptidi bioattivi o fattori di crescita, facendo reagire alcuni dei suoi gruppi acrilossisuccinimmidici con i gruppi –NH2 sui peptidi o fattori di crescita. Poiché l’idrogel di collagene-terpolimero (collagene-TERP) manca di un componente bioattivo, uno studio ha collegato ad esso un comune peptide di adesione cellulare trovato nella laminina(YIGSR) al fine di migliorare le sue proprietà di adesione cellulare.

Famiglia poli (acido lattico-co-glicolico).

I polimeri della famiglia PLGA includono poli (acido lattico) (PLA), poli (acido glicolico) (PGA) e il loro copolimero poli (acido lattico-co-glicolico) (PLGA). Tutti e tre i polimeri sono stati approvati dalla Food and Drug Administration per l’impiego in vari dispositivi. Questi polimeri sono fragili e non hanno regioni per la modifica chimica ammissibile; inoltre, si degradano alla rinfusa piuttosto che in superficie, il che non è un processo di degradazione regolare e ideale. Nel tentativo di superare la mancanza di funzionalità, le ammine libere sono state incorporate nelle loro strutture da cui i peptidi possono essere legati per controllare l’attaccamento e il comportamento delle cellule.

Destrano metacrilato (Dex-MA) copolimerizzato con amminoetil metacrilato (AEMA)

Il destrano è un polisaccaride derivato dai batteri; di solito è prodotto dagli enzimi di alcuni ceppi di leuconostoc o Streptococcus . Consiste di residui di D-glucopiranosio con legame α-1,6. Le sfere di idrogel di destrano reticolato sono state ampiamente utilizzate come matrici a basso legame proteico per la cromatografia su colonnaapplicazioni e per la tecnologia di coltura di cellule di microcarrier. Tuttavia, solo di recente gli idrogel di destrano sono stati studiati nelle applicazioni dei biomateriali e in particolare come veicoli per la somministrazione di farmaci. Un vantaggio dell’utilizzo di destrano nelle applicazioni dei biomateriali include la sua resistenza all’adsorbimento proteico e all’adesione cellulare, che consente di determinare l’adesione cellulare specifica mediante peptidi deliberatamente attaccati dai componenti ECM. AEMA è stato copolimerizzato con Dex-MA per introdurre gruppi amminici primari per fornire un sito per l’attacco di peptidi derivati ​​​​dall’ECM per promuovere l’adesione cellulare. I peptidi possono essere immobilizzati utilizzando la chimica dell’accoppiamento solfo-SMMC e peptidi terminati con cisteina.

Poli(glicerolo sebacato) (PGS)

Un nuovo elastomero resistente e biodegradabile è stato sviluppato dal poli(glicerolo sebacato) (PGS) per l’uso nella creazione di un condotto di guida nervosa. PGS è stato originariamente sviluppato per scopi di ingegneria dei tessuti molli per imitare in modo specifico le proprietà meccaniche dell’ECM. È considerato un elastomero perché è in grado di recuperare dalla deformazione in ambienti meccanicamente dinamici e di distribuire efficacemente lo stress in modo uniforme attraverso i tessuti rigeneranti sotto forma di microstress. Il PGS è sintetizzato da una reazione di policondensazione di glicerolo e acido sebacico, che può essere lavorato allo stato fuso o lavorato con solvente nella forma desiderata. PGS ha un modulo di Youngdi 0,28 MPa e un carico di rottura superiore a 0,5 MPa. Il nervo periferico ha un modulo di Young di circa 0,45 MPa, che è molto vicino a quello del PGS. Inoltre, il PGS subisce un degrado superficiale, accompagnato da perdite di massa lineare e forza durante il riassorbimento. Dopo l’impianto, l’emivita di degradazione è stata determinata in 21 giorni; il degrado completo si è verificato al giorno 60. Il PGS subisce un assorbimento d’acqua minimo durante il degrado e non presenta un rigonfiamento rilevabile; il gonfiore può causare distorsioni, che restringono il lume tubulare e possono impedire la rigenerazione. È vantaggioso che il tempo di degradazione del PGS possa essere variato modificando il grado di reticolazione e il rapporto tra acido sebacico e glicerolo. In uno studio di Sundback et al. (2005), i condotti PGS e PLGA impiantati avevano risposte tissutali precoci simili;

Idrogel di polietilenglicole

Glicole polietilenico(PEG) gli idrogel sono biocompatibili e hanno dimostrato di essere tollerati in molti tipi di tessuto, compreso il sistema nervoso centrale. Mahoney e Anseth hanno formato idrogel PEG fotopolimerizzando gruppi di metacrilato legati covalentemente a macromeri PEG degradabili. La degradazione dell’idrogel è stata monitorata nel tempo misurando la resistenza meccanica (modulo di compressione) e la dimensione media delle maglie dai dati del rapporto di rigonfiamento. Inizialmente, le catene polimeriche erano altamente reticolate, ma con il procedere della degradazione, i legami estere venivano idrolizzati, consentendo al gel di rigonfiarsi; il modulo di compressione è diminuito all’aumentare della dimensione della maglia fino a quando l’idrogel è stato completamente dissolto. È stato dimostrato che le cellule precursori neurali potevano essere fotoincapsulate e coltivate sui gel PEG con una morte cellulare minima. Poiché la dimensione della maglia è inizialmente piccola, l’idrogel blocca i segnali infiammatori e altri segnali inibitori dal tessuto circostante. All’aumentare della dimensione della maglia, l’idrogel è in grado di fungere da impalcatura per la rigenerazione degli assoni.

Biological polymers

Ci sono vantaggi nell’usare polimeri biologici rispetto ai polimeri sintetici. È molto probabile che abbiano una buona biocompatibilità e siano facilmente degradabili, perché sono già presenti in natura in qualche forma. Tuttavia, ci sono anche diversi svantaggi. Hanno proprietà meccaniche ingombranti e tassi di degradazione che non possono essere controllati su un’ampia gamma. Inoltre, c’è sempre la possibilità che i materiali di derivazione naturale possano causare una risposta immunitaria o contenere microbi. Nella produzione di materiali di derivazione naturale ci saranno anche variazioni da lotto a lotto nelle procedure di isolamento su larga scala che non possono essere controllate. Alcuni altri problemi che affliggono i polimeri naturali sono la loro incapacità di sostenere la crescita attraverso lunghe lacune della lesione a causa della possibilità di collasso, formazione di cicatrici e riassorbimento precoce.

Polysialic acid (PSA)

L’acido polisialico (PSA) è un materiale biocompatibile e bioriassorbibile relativamente nuovo per i condotti nervosi artificiali. È un omopolimero di residui di acido sialico legati a α2,8 e una modifica post-traduzionale regolata dinamicamente della molecola di adesione delle cellule neurali (NCAM). Recenti studi hanno dimostrato che la NCAM polisialilata (polySia-NCAM) promuove la rigenerazione del sistema motorio. Il PSA mostra stabilità in condizioni di coltura cellulare e consente la degradazione indotta dagli enzimi. Recentemente è stato anche scoperto che il PSA è coinvolto nei processi di guida come la neuritogenesi, la ricerca del percorso assonale e la migrazione dei neuroblasti. Gli animali con PSA geneticamente eliminato esprimono un fenotipo letale, che ha trovato un percorso senza successo; i nervi che collegano i due emisferi cerebrali erano aberranti o mancanti.

Collagene di tipo I/III

Collagene is the major component of the extracellular matrix and has been widely used in nerve regeneration and repair. Due to its smooth microgeometry and permeability, collagen gels are able to allow diffusion of molecules through them. Collagen resorption rates are able to be controlled by crosslinking collagen with polypoxy compounds. Additionally, collagen type I/III scaffolds have demonstrated good biocompatibility and are able to promote Schwann cell proliferation. However, collagen conduits filled with Schwann cells used to bridge nerve gaps in rats have shown surprisingly unsuccessful nerve regeneration compared to nerve autografts. This is because biocompatibility is not the only factor necessary for successful nerve regeneration; other parameters such as inner diameter, inner microtopography, porosity, wall thickness, and Schwann cell seeding density will need to be examined in future studies in order to improve the results obtained by these collagen I/III gels.

Spider silk fiber

Spider silk fibers are shown to promote cellular adhesion, proliferation, and vitality. Allmeling, Jokuszies et al. showed that Schwann cells attach quickly and firmly to the silk fibers, growing in a bipolar shape; proliferation and survival rates were normal on the silk fibers.

They used spider silk fibers to create a nerve conduit with Schwann cells and acellularized xenogenic veins. The Schwann cells formed columns along the silk fibers in a short amount of time, and the columns were similar to bands of Bungner that grow in vivo after PNS injury. Spider silk has not been used in tissue engineering until now because of the predatory nature of spiders and the low yield of silk from individual spiders. It has been discovered that the species Nephila clavipes produces silk that is less immunogenic than silkworm silk; it has a tensile strength of 4 x 109 N/m, which is six times the breaking strength of steel. Because spider silk is proteolytically degraded, there is not a shift in pH from the physiological pH during degradation. Other advantages of spider silk include its resistance to fungal and bacterial decomposition for weeks and the fact that it does not swell. Also, the silk’s structure promotes cell adhesion and migration. However, silk harvest is still a tedious task and the exact composition varies among species and even among individuals of the same species depending on diet and environment. There have been attempts to synthetically manufacture spider silk. Further studies are needed to test the feasibility of using a spider silk nerve conduit in vitro and in vivo.

Silkworm silk fibroin

In addition to spiders, silkworms are another source of silk. Protein from Bombyx mori silkworms is a core of fibroin protein surrounded by sericin, which is a family of glue-like proteins. Fibroin has been characterized as a heavy chain with a repeated hydrophobic and crystallizable sequence: Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-X (X stands for Ser or Tyr). The surrounding sericin is more hydrophilic due to many polar residues, but it does still have some hydrophobic β-sheet portions. Silks have been long been used as sutures due to their high mechanical strength and flexibility as well as permeability to water and oxygen. In addition, silk fibroin can be easily manipulated and sterilized. However, silk use halted when undesirable immunological reactions were reported. Recently, it has been discovered that the cause of the immunological problems lies solely with the surrounding sericin. Since this discovery, silk with the sericin removed has been used in many pharmaceutical and biomedical applications. Because it is necessary to remove the sericin from around the fibroin before the silk can be used, an efficient procedure needs to be developed for its removal, which is known as degumming. One degumming method uses boiling aqueous Na2CO3 solution, which removes the sericin without damaging the fibroin. Yang, Chen et al. demonstrated that the silk fibroin and silk fibroin extract fluid show good biocompatibility with Schwann cells, with no cytotoxic effects on proliferation.

Chitosan

Chitosan and chitin belong to a family of biopolymers composed of β(1–4)-linked N-acetyl-D-glucosamine and D-glucosamine subunits. Chitosan is formed by alkaline N-deacetylation of chitin, which is the second most abundant natural polymer after cellulose. Chitosan is a biodegradable polysaccharide that has been useful in many biomedical applications such as a chelating agent, drug carrier, membrane, and water treatment additive. Chitosan is soluble in dilute aqueous solutions, but precipitates into a gel at a neutral pH. It does not support neural cell attachment and proliferation well, but can be enhanced by ECM-derived peptide attachment. Chitosan also contains weak mechanical properties, which are more challenging to overcome.

Degree of acetylation (DA) for soluble chitosan ranges from 0% to 60%, depending on processing conditions. A study was conducted to characterize how varying DA affects the properties of chitosan. Varying DA was obtained using acetic anhydride or alkaline hydrolysis. It was found that decreasing acetylation created an increase in compressive strength. Biodegradation was examined by use of lysozyme, which is known to be mainly responsible for degrading chitosan in vivo by hydrolyzing its glycosidic bonds and is released by phagocytic cells after nerve injury. The results reveal that there was an accelerated mass loss with intermediate DAs, compared with high and low DAs over the time period studied. When DRG cells were grown on the N-acetylated chitosan, cell viability decreased with increasing DA. Also, chitosan has an increasing charge density with decreasing DA, which is responsible for greater cell adhesion. Thus, controlling the DA of chitosan is important for regulating the degradation time. This knowledge could help in the development of a nerve guidance conduit from chitosan.

Aragonite

È stato recentemente dimostrato che gli scaffold di aragonite supportano la crescita dei neuroni dall’ippocampo di ratto. Shany et al. (2006) hanno dimostrato che le matrici di aragonite possono supportare la crescita di reti astrocitiche in vitro e in vivo . Pertanto, gli scaffold di aragonite possono essere utili per la riparazione e la rigenerazione del tessuto nervoso. Si ipotizza che il Ca 2+ derivato dall’aragonite sia essenziale per promuovere l’adesione cellulare e il contatto cellula-cellula. Questo è probabilmente realizzato attraverso l’aiuto di molecole di adesione dipendenti da Ca 2+ come le caderine. Le matrici cristalline di aragonite presentano molti vantaggi rispetto agli idrogel. Hanno pori più grandi, che consentono una migliore crescita cellulare, e il materiale è bioattivo come risultato del rilascio di Ca 2+, che promuove l’adesione cellulare e la sopravvivenza. Inoltre, le matrici di aragonite hanno una resistenza meccanica maggiore rispetto agli idrogel, consentendo loro di sopportare una pressione maggiore quando vengono premute su un tessuto leso.

Alginato

L’alginato è un polisaccaride che forma prontamente catene; può essere reticolato nei suoi gruppi carbossilici con cationi multivalenti come Cu 2+ , Ca 2+ o Al 3+per formare un idrogel meccanicamente più stabile. Gli alginati di calcio formano polimeri che sono sia biocompatibili che non immunogenici e sono stati utilizzati in applicazioni di ingegneria tissutale. Tuttavia, non sono in grado di supportare una crescita orientata longitudinalmente, necessaria per la riconnessione dell’estremità prossimale con il suo bersaglio. Per superare questo problema, sono stati sviluppati idrogel capillari anisotropici (ACH). Sono creati sovrapponendo soluzioni acquose di alginato di sodio con soluzioni acquose di cationi multivalenti in strati. Dopo la formazione, gli ioni dell’elettrolita si diffondono negli strati della soluzione polimerica e un processo convettivo dissipativo provoca la precipitazione degli ioni, creando capillari. Il processo convettivo dissipativo risulta dall’opposizione dei gradienti di diffusione e dall’attrito tra icatene polielettrolitiche . Le pareti dei capillari sono rivestite con l’alginato metallico precipitato, mentre il lume è riempito con l’acqua estrusa.

Prang et al. (2006) hanno valutato la capacità dei gel ACH di promuovere la ricrescita assonale diretta nel SNC dei mammiferi feriti. Gli ioni multivalenti utilizzati per creare i gel ACH a base di alginato erano ioni di rame, la cui diffusione negli strati di alginato di sodio creava gel capillari anisotropici a struttura esagonale. Dopo la precipitazione, l’intero gel è stato attraversato da capillari orientati longitudinalmente. Le impalcature ACH hanno promosso la sopravvivenza degli NPC adulti e la rigenerazione degli assoni altamente orientata. Questo è il primo esempio di utilizzo di alginati per produrre gel capillari strutturati anisotropi. Sono necessari studi futuri per studiare la stabilità fisica a lungo termine degli scaffold ACH, poiché la rigenerazione degli assoni del SNC può richiedere molti mesi; tuttavia, oltre a poter fornire un supporto a lungo termine, le impalcature devono anche essere degradabili. Di tutti i biopolimeri biologici e sintetici studiati da Prang et al. (2006), solo i gel a base di agarosio sono stati in grado di confrontarsi con la rigenerazione lineare causata dagli scaffold ACH. Studi futuri dovranno anche indagare se gli scaffold ACH consentono la reinnervazione del bersaglioin vivo dopo una lesione del midollo spinale.

Idrogel di acido ialuronico

Acido ialuronico(HA) è un biomateriale ampiamente utilizzato grazie alla sua eccellente biocompatibilità e alla sua diversità di funzioni fisiologiche. È abbondante nella matrice extracellulare (ECM) dove lega grandi glicosaminoglicani (GAG) e proteoglicani attraverso specifiche interazioni HA-proteina. L’HA lega anche i recettori della superficie cellulare come il CD44, il che si traduce nell’attivazione di cascate di segnali intracellulari che regolano l’adesione e la motilità cellulare e promuovono la proliferazione e la differenziazione. L’HA è anche noto per supportare l’angiogenesi perché i suoi prodotti di degradazione stimolano la proliferazione e la migrazione delle cellule endoteliali. Pertanto, l’HA svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento dei normali processi necessari per la sopravvivenza dei tessuti. L’HA non modificato è stato utilizzato in applicazioni cliniche come la chirurgia oculare, la guarigione delle ferite e la chirurgia plastica. L’HA può essere reticolato per formare idrogel. Gli idrogel di HA non modificati o modificati con laminina sono stati impiantati in una lesione del sistema nervoso centrale adulto e testati per la loro capacità di indurre la formazione di tessuto neurale in uno studio di Hou et al.. Hanno dimostrato la capacità di supportare la crescita cellulare e l’angiogenesi, in oltre a inibire la formazione di cicatrici gliali. Inoltre, gli idrogel di HA modificati con laminina sono stati in grado di promuovere l’estensione dei neuriti. Questi risultati supportano i gel HA come biomateriale promettente per un condotto di guida nervosa. oltre a inibire la formazione di cicatrici gliali. Inoltre, gli idrogel di HA modificati con laminina sono stati in grado di promuovere l’estensione dei neuriti. Questi risultati supportano i gel HA come biomateriale promettente per un condotto di guida nervosa. oltre a inibire la formazione di cicatrici gliali. Inoltre, gli idrogel di HA modificati con laminina sono stati in grado di promuovere l’estensione dei neuriti. Questi risultati supportano i gel HA come biomateriale promettente per un condotto di guida nervosa.

Terapie cellulari

Oltre al materiale dell’impalcatura e ai segnali fisici, anche i segnali biologici possono essere incorporati in un condotto nervoso bioartificiale sotto forma di cellule. Nel sistema nervoso ci sono molti diversi tipi di cellule che aiutano a sostenere la crescita e il mantenimento dei neuroni. Queste cellule sono chiamate collettivamente cellule gliali. Le cellule gliali sono state studiate nel tentativo di comprendere i meccanismi alla base delle loro capacità di promuovere la rigenerazione degli assoni. Vengono discussi tre tipi di cellule gliali: cellule di Schwann, astrociti e cellule olfattive ensheathing. Oltre alle cellule gliali, anche le cellule staminali hanno potenziali benefici per la riparazione e la rigenerazione perché molte sono in grado di differenziarsi in neuroni o cellule gliali. Questo articolo discute brevemente l’uso di cellule staminali mesenchimali adulte, transdifferenziate, ectomesenchimali, neurali e progenitrici neurali.

Cellule gliali

Le cellule gliali sono necessarie per supportare la crescita e il mantenimento dei neuroni nel sistema nervoso periferico e centrale. La maggior parte delle cellule gliali sono specifiche del sistema nervoso periferico o centrale. Le cellule di Schwann si trovano nel sistema nervoso periferico dove mielinizzano gli assoni dei neuroni. Gli astrociti sono specifici del sistema nervoso centrale; forniscono nutrienti, supporto fisico e isolamento per i neuroni. Formano anche la barriera ematoencefalica. Le cellule ensheathing olfattive, tuttavia, attraversano il confine CNS-PNS, perché guidano i neuroni del recettore olfattivo dal SNP al SNC.

Cellule di Schwann

Le cellule di Schwann (SC) sono cruciali per la rigenerazione dei nervi periferici; svolgono ruoli sia strutturali che funzionali. Le cellule di Schwann sono responsabili della partecipazione sia alla degenerazione walleriana che alle bande di Bungner. Quando un nervo periferico viene danneggiato, le cellule di Schwann alterano la loro morfologia, comportamento e proliferazione per essere coinvolte nella degenerazione wallerianae bande Bungner. Nella degenerazione walleriana, le cellule di Schwann crescono in colonne ordinate lungo il tubo endoneurale, creando una banda di Bungner (boB) che protegge e preserva il canale endoneurale. Inoltre, rilasciano fattori neurotrofici che migliorano la ricrescita insieme ai macrofagi. Ci sono alcuni svantaggi nell’usare le cellule di Schwann nell’ingegneria dei tessuti neurali; ad esempio, è difficile isolare selettivamente le cellule di Schwann e mostrano una scarsa proliferazione una volta isolate. Un modo per superare questa difficoltà è indurre artificialmente altre cellule come le cellule staminali in fenotipi simili a SC.

Eguchi et al. (2003) hanno studiato l’uso dei campi magnetici per allineare le cellule di Schwann. Hanno usato un magnete superconduttore di tipo orizzontale, che produce un campo di 8 T al suo centro. Entro 60 ore dall’esposizione, le cellule di Schwann si sono allineate parallelamente al campo; durante lo stesso intervallo, le cellule di Schwann non esposte si sono orientate in modo casuale. Si ipotizza che le differenze nella suscettibilità al campo magnetico dei componenti della membrana e degli elementi del citoscheletro possano causare l’orientamento magnetico. Anche le fibre di collagene sono state esposte al campo magnetico e, entro 2 ore, si sono allineate perpendicolarmente al campo magnetico, mentre le fibre di collagene hanno formato un reticolo casuale senza esposizione al campo magnetico. Quando coltivato sulle fibre di collagene, Le cellule di Schwann si sono allineate lungo il collagene orientato magneticamente dopo due ore di esposizione al campo magnetico 8-T. Al contrario, le cellule di Schwann si sono orientate in modo casuale sulle fibre di collagene senza esposizione al campo magnetico. Pertanto, la coltura su fibre di collagene ha permesso alle cellule di Schwann di essere orientate perpendicolarmente al campo magnetico e orientate molto più rapidamente.

Questi risultati possono essere utili per allineare le cellule di Schwann in una lesione del sistema nervoso per promuovere la formazione di bande di Bungner, che sono cruciali per mantenere il tubo endoneurale che guida gli assoni in ricrescita verso i loro obiettivi. È quasi impossibile allineare le cellule di Schwann con tecniche fisiche esterne; quindi, la scoperta di una tecnica alternativa per l’allineamento è significativa. Tuttavia, la tecnica sviluppata presenta ancora i suoi svantaggi, vale a dire che richiede una notevole quantità di energia per sostenere il campo magnetico per periodi prolungati.

Sono stati condotti studi nel tentativo di migliorare la capacità migratoria delle cellule di Schwann. La migrazione delle cellule di Schwann è regolata dalle integrine con molecole ECM come fibronectina e laminina. Inoltre, è noto che la molecola di adesione delle cellule neurali ( NCAM ) migliora la motilità delle cellule di Schwann in vitro . NCAM è una glicoproteina espressa sulle membrane cellulari assonali e di Schwann. L’acido polisialico (PSA) è sintetizzato su NCAM da polisialyltransferase (PST) e sialyltransferase X (STX). Durante lo sviluppo del sistema nervoso centrale, l’espressione del PSA su NCAM è sovraregolata fino alle fasi postnatali. Tuttavia, nel cervello adulto il PSA si trova solo nelle regioni con elevata plasticità . L’espressione del PSA non si verifica sulle cellule di Schwann.

Lavdas et al. (2006) hanno studiato se l’espressione prolungata di PSA sulle cellule di Schwann migliora la loro migrazione. Le cellule di Schwann sono state tradotte con un vettore retrovirale che codifica STX per indurre l’espressione di PSA. Le cellule di Schwann che esprimono PSA hanno ottenuto una maggiore motilità, come dimostrato in un test di gap bridging e dopo l’innesto in colture di fette di proencefalo postnatale. L’espressione del PSA non ha alterato la differenziazione molecolare e morfologica. Le cellule di Schwann che esprimono PSA sono state in grado di mielinizzare gli assoni del SNC in fette cerebellari, cosa che normalmente non è possibile in vivo . Si spera che queste cellule di Schwann che esprimono PSA siano in grado di migrare attraverso il sistema nervoso centrale senza perdita di capacità mielinizzanti e possano diventare utili per la rigenerazione e la mielinizzazione degli assoni nel sistema nervoso centrale.

Astrociti

Astrocytes are glial cells that are abundant in the central nervous system. They are crucial for the metabolic and trophic support of neurons; additionally, astrocytes provide ion buffering and neurotransmitter clearance. Growing axons are guided by cues created by astrocytes; thus, astrocytes can regulate neurite pathfinding and subsequently, patterning in the developing brain. The glial scar that forms post-injury in the central nervous system is formed by astrocytes and fibroblasts; it is the most significant obstacle for regeneration. The glial scar consists of hypertrophied astrocytes, connective tissue, and ECM. Two goals of neural tissue engineering are to understand astrocyte function and to develop control over astrocytic growth. Studies by Shany et al. (2006) have demonstrated that astrocyte survival rates are increased on 3D aragonite matrices compared to conventional 2D cell cultures. The ability of cell processes to stretch out across curves and pores allows for the formation of multiple cell layers with complex 3D configurations.

The three distinct ways by which the cells acquired a 3D shape are:

  1. adhering to surface and following the 3D contour
  2. stretching some processes between 2 curvatures
  3. extending processes in 3D within cell layers when located within multilayer tissue

In conventional cell culture, growth is restricted to one plane, causing monolayer formation with most cells contacting the surface; however, the 3D curvature of the aragonite surface allows multiple layers to develop and for astrocytes far apart to contact each other. It is important to promote process formation similar to 3D in vivo conditions, because astrocytic process morphology is essential in guiding directionality of regenerating axons. The aragonite topography provides a high surface area to volume ratio and lacks edges, which leads to a reduction of the culture edge effect. Crystalline matrices such as the aragonite mentioned here are allowed for the promotion of a complex 3D tissue formation that approaches in vivo conditions.

Olfactory ensheathing cells

The mammalian primary olfactory system has retained the ability to continuously regenerate during adulthood. Olfactory receptor neurons have an average lifespan of 6–8 weeks and therefore must be replaced by cells differentiated from the stem cells that are within a layer at the nearby epithelium’s base. The new olfactory receptor neurons must project their axons through the CNS to an olfactory bulb in order to be functional. Axonal growth is guided by the glial composition and cytoarchitecture of the olfactory bulb in addition to the presence of olfactory ensheathing cells (OECs).

It is postulated that OECs originate in the olfactory placode, suggesting a different developmental origin than other similar nervous system microglia.

Another interesting concept is that OECs are found in both the peripheral and central nervous system portions of the primary olfactory system, that is, the olfactory epithelium and bulb.

OECs are similar to Schwann cells in that they provide an upregulation of low-affinity NGF receptor p75 following injury; however, unlike Schwann cells they produce lower levels of neurotrophins. Several studies have shown evidence of OECs being able to support regeneration of lesioned axons, but these results are often unable to be reproduced. Regardless, OECs have been investigated thoroughly in relation to spinal cord injuries, amyotrophic lateral sclerosis, and other neurodegenerative diseases. Researchers suggest that these cells possess a unique ability to remyelinate injured neurons.

OECs have properties similar to those of astrocytes, both of which have been identified as being susceptible to viral infection.

Stem cells

Stem cells are characterized by their ability to self-renew for a prolonged time and still maintain the ability to differentiate along one or more cell lineages. Stem cells may be unipotent, multipotent, or pluripotent, meaning they can differentiate into one, multiple, or all cell types, respectively. Pluripotent stem cells can become cells derived from any of the three embryonic germ layers. Stem cells have the advantage over glial cells because they are able to proliferate more easily in culture. However, it remains difficult to preferentially differentiate these cells into varied cell types in an ordered manner. Another difficulty with stem cells is the lack of a well-defined definition of stem cells beyond hematopoietic stem cells (HSCs). Each stem cell ‘type’ has more than one method for identifying, isolating, and expanding the cells; this has caused much confusion because all stem cells of a ‘type’ (neural, mesenchymal, retinal) do not necessarily behave in the same manner under identical conditions.

Adult stem cells

Adult stem cells are not able to proliferate and differentiate as effectively in vitro as they are able to in vivo. Adult stem cells can come from many different tissue locations, but it is difficult to isolate them because they are defined by behavior and not surface markers. A method has yet to be developed for clearly distinguishing between stem cells and the differentiated cells surrounding them. However, surface markers can still be used to a certain extent to remove most of the unwanted differentiated cells. Stem cell plasticity is the ability to differentiate across embryonic germ line boundaries. Though, the presence of plasticity has been hotly contested. Some claim that plasticity is caused by heterogeneity among the cells or cell fusion events. Currently, cells can be differentiated across cell lines with yields ranging from 10% to 90% depending on techniques used. More studies need to be done in order to standardize the yield with transdifferentiation. Transdifferentiation of multipotent stem cells is a potential means for obtaining stem cells that are not available or not easily obtained in the adult.

Mesenchymal stem cells

Mesenchymal stem cells are adult stem cells that are located in the bone marrow; they are able to differentiate into lineages of mesodermal origin. Some examples of tissue they form are bone, cartilage, fat, and tendon. MSCs are obtained by aspiration of bone marrow. Many factors promote the growth of MSCs including: platelet-derived growth factor, epidermal growth factor β, and insulin-like growth factor-1. In addition to their normal differentiation paths, MSCs can be transdifferentiated along nonmesenchymal lineages such as astrocytes, neurons, and PNS myelinating cells. MSCs are potentially useful for nerve regeneration strategies because:

  1. il loro uso non è una preoccupazione etica
  2. non è necessaria alcuna immunosoppressione
  3. sono una risorsa abbondante e accessibile
  4. tollerano le manipolazioni genetiche

Keiloff et al. (2006) hanno condotto uno studio confrontando la capacità di rigenerazione nervosa delle MSC non differenziate e transdifferenziate con le cellule di Schwann in innesti muscolari devitalizzati che colmano un gap di 2 cm nel nervo sciatico di ratto. Tutte le cellule erano autologhe. Le MSC transdifferenziate sono state coltivate in una miscela di fattori per promuovere la formazione di cellule simili a cellule di Schwann. Le MSC indifferenziate non hanno dimostrato alcuna capacità rigenerativa, mentre le MSC transdifferenziate hanno mostrato una certa capacità rigenerativa, sebbene non abbia raggiunto la capacità delle cellule di Schwann.

Cellule staminali ectomesenchimali

La difficoltà di isolare le cellule di Schwann e successivamente di indurre la proliferazione è un grande ostacolo. Una soluzione consiste nell’indurre selettivamente cellule come le cellule staminali ectomesenchimali (EMSC) in fenotipi simili a cellule di Schwann. Gli EMSC sono cellule della cresta neurale che migrano dalla cresta neurale craniale al primo arco branchiale durante lo sviluppo iniziale del sistema nervoso periferico. Gli EMSC sono multipotenti e possiedono una capacità di auto-rinnovamento. Possono essere considerate cellule progenitrici di Schwann perché sono associate al ganglio della radice dorsale e allo sviluppo dei nervi motori. La differenziazione EMSC sembra essere regolata da programmi genetici intrinseci e segnali extracellulari nell’ambiente circostante. Le cellule di Schwann sono la fonte sia di neurotropi che difattori neurotrofici essenziali per la rigenerazione dei nervi e un’impalcatura per guidare la crescita. Nie, Zhang et al. ha condotto uno studio che esamina i vantaggi della coltura di EMSC all’interno di condotti PLGA. L’aggiunta di foskolina e BPE a una coltura EMSC ha causato la formazione di processi cellulari allungati, che è comune alle cellule di Schwann in vitro . Pertanto, foskolin e BPF possono indurre la differenziazione in fenotipi simili a cellule di Schwann. Il BPE contiene le citochine GDNF , il fattore di crescita dei fibroblasti di base e il fattore di crescita derivato dalle piastrine , che causano la differenziazione e la proliferazione delle cellule gliali e di Schwann attivando le MAP chinasi. Quando impiantati nei condotti PLGA, gli EMSC hanno mantenuto la sopravvivenza a lungo termine e hanno promosso la rigenerazione dei nervi periferici attraverso uno spazio di 10 mm, che di solito dimostra una rigenerazione minima o nulla. All’interno degli innesti erano presenti assoni mielinizzati e all’interno della mielina si formavano lamine basali. Queste osservazioni suggeriscono che gli EMSC possono promuovere la mielinizzazione delle fibre nervose rigenerate all’interno del condotto.

Cellule progenitrici neurali

L’inserimento di neuroni in un condotto nervoso bioartificiale sembra il metodo più ovvio per sostituire i nervi danneggiati; tuttavia, i neuroni non sono in grado di proliferare e spesso hanno vita breve in coltura. Pertanto, le cellule progenitrici neurali sono candidati più promettenti per la sostituzione dei neuroni danneggiati e degenerati perché sono auto-rinnovanti, il che consente l’ in vitroproduzione di molte cellule con materiale donatore minimo. Per confermare che i nuovi neuroni formati da cellule progenitrici neurali fanno parte di una rete funzionale, è richiesta la presenza della formazione di sinapsi. Uno studio di Ma, Fitzgerald et al. è la prima dimostrazione di sinapsi funzionale derivata da cellule staminali neurali e progenitrici murine e formazione di reti neuronali su una matrice di collagene 3D. Le cellule progenitrici neurali si espansero e si differenziarono spontaneamente in neuroni eccitabili e formarono sinapsi; inoltre, hanno mantenuto la capacità di differenziarsi nei tre lignaggi del tessuto neurale. È stato inoltre dimostrato che non solo si è verificato il riciclo attivo delle vescicole sinaptiche, ma anche che si sono formate connessioni eccitatorie e inibitorie in grado di generare spontaneamente potenziali d’azione. Così,

Cellule staminali neurali

Cellule staminali neurali(NSC) hanno la capacità di auto-rinnovarsi e di differenziarsi in lignaggi neuronali e gliali. Sono stati sviluppati molti metodi di coltura per dirigere la differenziazione delle NSC; tuttavia, la creazione di biomateriali per dirigere la differenziazione delle NSC è vista come una tecnologia clinicamente più rilevante e utilizzabile. Un approccio per sviluppare un biomateriale per dirigere la differenziazione NSC consiste nel combinare componenti della matrice extracellulare (ECM) e fattori di crescita. Uno studio molto recente di Nakajima, Ishimuro et al. ha esaminato gli effetti di diverse coppie molecolari costituite da un fattore di crescita e un componente ECM sulla differenziazione delle NSC in astrociti e cellule neuronali. I componenti ECM studiati erano laminina-1 e fibronectina, che sono componenti ECM naturali, e ProNectin F plus (Pro-F) e ProNectin L (Pro-L), che sono componenti ECM artificiali, e poli(etilenimmina) (PEI). Ili fattori neurotrofici utilizzati erano il fattore di crescita epidermico (EGF), il fattore di crescita dei fibroblasti -2 (FGF-2), il fattore di crescita nervoso (NGF), la neurotrofina-3 (NT-3) e il fattore neurotrofico ciliare (CNTF). Le combinazioni di coppie sono state immobilizzate su array di cellule di matrice, su cui sono state coltivate le NSC. Dopo 2 giorni di coltura, le cellule sono state colorate con anticorpi contro nestina , β- tubulina III e GFAP , che sono marcatori rispettivamente per NSC, cellule neuronali e astrociti. I risultati forniscono preziose informazioni su combinazioni vantaggiose di componenti ECM e fattori di crescita come metodo pratico per lo sviluppo di un biomateriale per dirigere la differenziazione delle NSC.

Fattori neurotrofici

Attualmente, i fattori neurotrofici vengono intensamente studiati per l’uso nei condotti nervosi bioartificiali perché sono necessari in vivo per dirigere la crescita e la rigenerazione degli assoni. Negli studi, i fattori neurotrofici vengono normalmente utilizzati insieme ad altre tecniche come segnali biologici e fisici creati dall’aggiunta di cellule e topografie specifiche. I fattori neurotrofici possono o meno essere immobilizzati alla struttura dell’impalcatura, sebbene l’immobilizzazione sia preferita perché consente la creazione di gradienti permanenti e controllabili. In alcuni casi, come i sistemi di somministrazione di farmaci neurali, sono liberamente immobilizzati in modo tale da poter essere rilasciati selettivamente in momenti specifici e in quantità specificate. La somministrazione di farmaci è il passo successivo rispetto all’aggiunta di base di fattori di crescita ai condotti di guida nervosa.

Materiali biomimetici

Molti biomateriali utilizzati per i condotti di guida nervosa sono materiali biomimetici . I materiali biomimetici sono materiali che sono stati progettati in modo tale da suscitare risposte cellulari specificate mediate da interazioni con peptidi legati all’impalcatura dalle proteine ​​​​ECM; essenzialmente, l’incorporazione di peptidi che legano le cellule nei biomateriali tramite modifica chimica o fisica.

Sinergismo

Il sinergismo si verifica spesso quando due elementi sono combinati; è un’interazione tra due elementi che provoca un effetto maggiore degli effetti combinati di ciascun elemento separatamente. Il sinergismo è evidente nella combinazione di materiale e topografia dell’impalcatura con terapie cellulari, fattori neurotrofici e materiali biomimetici. L’indagine sul sinergismo è il passo successivo dopo che le singole tecniche hanno dimostrato di avere successo da sole. Le combinazioni di questi diversi fattori devono essere attentamente studiate per ottimizzare gli effetti sinergici.

Ottimizzazione delle combinazioni di fattori neurotrofici

È stato ipotizzato che le interazioni tra fattori neurotrofici possano alterare le concentrazioni ottimali di ciascun fattore. Sebbene la sopravvivenza cellulare e il mantenimento del fenotipo siano importanti, l’enfasi della valutazione era sull’estensione dei neuriti. Una combinazione di NGF , fattore neurotrofico derivato dalla linea cellulare gliale ( GDNF ) e fattore neurotrofico ciliare ( CNTF ) è stata presentata alle colture di gangli della radice dorsale in vitro. È stato utilizzato un fattore per ciascuna famiglia neurotrofica. È stato determinato che non vi è differenza nella concentrazione ottimale individuale e nella concentrazione ottimale combinatoria; tuttavia, intorno al giorno 5 o 6 i neuriti cessarono di estendersi e iniziarono a degradarsi. Si ipotizzava che ciò fosse dovuto alla mancanza di un nutriente critico o di gradienti adeguati; studi precedenti hanno dimostrato che i fattori di crescita sono in grado di ottimizzare al meglio l’estensione dei neuriti se presentati in gradienti. Futuri studi sulle combinazioni di fattori neurotrofici dovranno includere i gradienti.

Combinazione di molecole di adesione delle cellule neurali e GFD-5

Molecole di adesione cellulare (CAM) e fattori neurotrofici incorporati insieme in matrici biocompatibili è un concetto relativamente nuovo oggetto di indagine. Le CAM della superfamiglia delle immunoglobuline (IgSF), che comprende L1/NgCAM e neurofascina, sono particolarmente promettenti, perché sono espresse nel sistema nervoso in via di sviluppo sui neuroni o sulle cellule di Schwann. Sono noti per servire come segnali di guida e mediare la differenziazione neuronale. Fattori neurotrofici come NGF e fattore di differenziazione della crescita 5 (GDF-5), tuttavia, sono ben consolidati come promotori della rigenerazione in vivo. Un recente studio di Niere, Brown et al. studiato gli effetti sinergici della combinazione di L1 e neurofascina con NGF e GDF-5 sui neuroni DRG in coltura; questa combinazione ha migliorato la crescita dei neuriti. Un ulteriore miglioramento è stato dimostrato combinando L1 e neurofascina in una proteina di fusione artificiale, che migliora l’efficienza poiché i fattori non vengono forniti individualmente. Non solo è possibile utilizzare diversi segnali, ma possono anche essere fusi in un unico “nuovo” segnale.

Topografia in sinergia con indizi chimici e biologici

L’effetto della presentazione di più tipi di stimoli come segnali chimici, fisici e biologici sulla differenziazione delle cellule progenitrici neurali non è stato esplorato. È stato condotto uno studio in cui sono stati presentati tre diversi stimoli alle cellule progenitrici dell’ippocampo di ratto adulto (AHPC): astrociti postnatali di tipo 1 di ratto (biologici), laminina (chimica) e substrato micropatternato (fisico). Oltre il 75% degli AHPC allineati entro 20° dalle scanalature rispetto alla crescita casuale sui substrati senza motivi. Quando gli AHPC sono stati coltivati ​​su substrati micropatternizzati con astrociti, la crescita è stata influenzata dagli astrociti che si erano allineati con i solchi; vale a dire, gli AHPC hanno esteso i processi lungo i filamenti citoscheletrici astrocitari. Tuttavia, l’allineamento non era così significativo come quello visto dagli AHPC nella sola coltura con il substrato micropatternizzato. Al fine di valutare i diversi fenotipi espressi come risultato della differenziazione, le cellule sono state colorate con anticorpi per la β-tubulina di classe III (TuJI), la proteina che interagisce con il recettore (RIP) e la proteina acida fibrillare gliale (GFAP), che sono marcatori per neuroni precoci, oligodendrociti e astrociti, rispettivamente. La maggiore quantità di differenziazione è stata osservata con AHPC coltivati ​​su substrati modellati con astrociti.


https://en.wikipedia.org/wiki/Nerve_guidance_conduit

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